流动注射法测定不同水体中总磷的比对研究
黄亮，关念云，罗清莉，张奇*
（广东省韶关生态环境监测中心站， 广东 韶关 512026）
摘要:利用北京吉天iFIA7型流动注射分析仪对地表水和生活污水中的总磷进行测定，主要从校准曲线、标准物质、空白样品、实际样品，加标回收率、准确度、精密度、检出限、方法比对几个方面分析研究。结果显示，相关系数达到0.9999，检出限为0.004mg/L，测定下限为0.016mg/L，用实际样品测得加标回收率为96.2%~106%。对高低两个不同浓度标准样品进行7次平行测定，测得值均在保证值范围内，其相对标准偏差分别为0.67%和1.55%。通过与钼酸铵分光光度法的比对试验显示，不论对于地表水还是污水，流动注射法与钼酸铵分光光度法测试相关性较好，在保证准确度的情况下其分析效率更高，尤其有助于应对大批量样品的快速分析，因此该方法已成为目前测定总磷最主要的分析法之一。
关键词：流动注射；总磷；准确度；检出限；方法比对；加标回收率
中图分类号：X832 文献标识码：A
Comparative study on determination of total phosphorus in different water bodies by flow injection method
Huang Liang, Guan Nian Yun, LuoQingLi, Zhang Qi*
( Shaoguan Ecological Environment Monitoring Center Station of Guangdong Province , Shaoguan 512026, China)
Abstract: The total phosphorus in surface water and domestic sewage was determined by using Beijing Jitian iFIA7 flow injection analyzer, mainly from calibration curve, standard material, blank sample, actual sample, spiked recovery, accuracy, precision, detection limit, method comparison and other aspects. The results showed that the correlation coefficient reached 0.9999, the detection limit was 0.004mg/L, the lower limit of determination was 0.016mg/L, and the recovery rate of standard addition measured with actual samples was 96.2%~106%. Seven parallel determinations were carried out on the two different concentration standard samples, and the measured values were within the guaranteed value range, with the relative standard deviation of 0.67% and 1.55% respectively. The comparison test with ammonium molybdate spectrophotometry shows that the flow injection method has a good correlation with ammonium molybdate spectrophotometry for both surface water and sewage, and its analytical efficiency is higher under the condition of ensuring accuracy, especially for the rapid analysis of large quantities of samples. Therefore, this method has become one of the most important analytical methods for the determination of total phosphorus at present.
Key words: Flow injection; Total phosphorus; Accuracy; Detection limit; Method comparison; Recovery rate of spiking
引言：总磷是反映水体富营养化的主要指标，也是衡量水质的重要指标。当水体中含磷化合物的含量超过一定范围时，在适当的条件下，水体中的藻类会大量繁殖，出现富营养化现象，严重影响水生生物和水生态环境安全，因此建立一种快速、灵敏而简便的方法测定水体中总磷具有重要意义[1]。总磷的监测方法主要分为手工监测方法和自动监测方法，其中最经典、最有代表性的手工方法为钼酸铵分光光度法（GB/T 11893-1989），被绝大部分实验室所采用，已成熟应用几十年，具有良好的分析效果，自动监测技术目前主要应用于重点监控断面水站的建设。
流动注射分析法测定水中的总磷是近年来发展起来的一种实验室分析方法，它是在连续流动分析技术上发展而来，而且随着科技的进步和实验室分析技术的发展，流动注射分析技术正越来越多地在科研和生产中得到应用和普及[2]。流动注射法是通过准确地控制注入流路系统中的样品体积和液体流速来获得最佳的重现性，不需要像连续流动那样用气泡隔开也能避免样品出现交叉污染现象，其非稳态显色分析理论是传统分析化学理论的一次重大突破[3]。通过对地表水和生活污水两个不同类型的样品分析测试，以及与钼酸铵分光光度法的比对研究表明，流动注射分析法测定总磷，是集消解、加试剂、定容、显色和测定为一体的实验室自动分析技术，具有取样量少、精确度高、试剂消耗少、废液产生少、分析速度快等优点，可使分析人员从繁琐的体力劳动中解放出来[4]，既节约了大量时间，又避免实验人员长时间接触试剂对身体带来的危害。随着样品量的日益增多和监测要求的不断提高，钼酸铵分光光度法已很难满足分析要求，而流动注射法更符合未来生态环境监测技术的发展方向。
1、实验部分
1.1实验原理
水样经过硫酸钾和紫外在线消解将各种形态的磷全部被氧化为正磷酸盐，在酸性介质和锑盐的催化下，正磷酸盐与钼酸铵反应生成磷钼杂多酸，该化合物被抗坏血酸还原成蓝色络合物，于880nm波长处测量吸光度[5]，其信号值（峰面积）通过工作站采集，由数据处理系统自动计算分析处理。
1.2仪器和设备
流动注射分析仪，iFIA7型，北京吉天仪器有限公司，包括自动进样器、化学分析单元、检测单元、数据处理单元、加热池和紫外消解装置。超声波清洗器，频率40kHz，上海科导超声仪器有限公司。循环水式真空泵，SHZ-D(III)型，河南予华仪器有限公司。艾柯超纯水机，Advanced-IV-32型。表层采水器（聚乙烯），1L 玻璃样品瓶。
1.3试剂和材料
1.3.1纯水：采用新制备的一级纯水，超声脱气后待用。
1.3.2总磷分析试剂：过硫酸钾溶液、显色剂、 抗坏血酸溶液均使用北京益利精细化学品有限公司生产的分析纯试剂包，按厂家配制说明配制后超声脱气待用，保存期一周左右。
1.3.3总磷标准贮备液：ρ=500mg/L，北京坛墨质检科技有限公司，GBW（E）083181b-1。
1.3.4总磷中间液：ρ=20.0mg/L。取4.00mL总磷标准贮备液（1.3.3）于100 ml容量瓶中，用水稀释至标线后待用。
1.3.5总磷标准使用液：ρ=1.00mg/L。取5.00 ml总磷中间液（1.3.4）于100 ml容量瓶中，用水稀释至标线后待用。
1.3.6总磷标准样品：ρ=1.14±0.05mg/L，生态环境部标准样品研究所，质控编号：200219。
1.3.7总磷标准样品：ρ=0.270±0.016mg/L，生态环境部标准样品研究所，质控编号：200645。
1.4样品的采集和保存
按照 HJ/T 91-2002[6]和HJ 91.1-2019[7]的相关规定采集样品。在采样前，用水荡洗所有接触样品的器皿至少三次以上，地表水样品需在现场自然静置30min后取上清液采集于清洗过的聚乙烯或玻璃瓶中，静置后浊度仍较高需适当延长静置时间或离心方式处理，污水采样时注意避开树枝等漂浮物，一般在排放口采样。水样采集后立即加入硫酸至pH≤2保存固定，须在24h内分析测定。
2、分析步骤
2.1设定参数
进样时间40s，进样针清洗时间60s，清洗时间60s，进样周期120s，检测波长880nm，前端采集10k，到达阀时间65s，注射时间50s，出峰时间125s，积分宽度100s，泵速30 r/min。
2.2调试仪器
严格按照仪器的操作规程使用仪器，开机后仪器会自检，自检合格后用纯水代替所有试剂，泵入系统检查整个分析流路的密闭性及液体流动的顺畅性，约15min后基线趋于稳定，把各泵管分别放入各试剂瓶，仪器开始泵入试剂，约10min待基线再次稳定后进行分析操作。
2.3制备校准系列
移取总磷标准使用液（1.3.5）至大号试样管中，放置到37号样品位，自动标配校准系列，配置浓度分别为0.00、0.05、0.1、0.2、0.5、1.00 mg/L，从低浓度到高浓度依次进行测试，校准系列制备见表1。
表1 标准溶液校准系列
序号 | 已知浓度（mg/L） | 峰面积 | 回算浓度（mg/L） | 相关系数 |
1 | 0.000 | -0.0815 | 0.000 | 0.9999 |
2 | 0.050 | 1.8791 | 0.049 | |
3 | 0.100 | 3.6796 | 0.095 | |
4 | 0.200 | 7.8674 | 0.204 | |
5 | 0.500 | 19.5862 | 0.509 | |
6 | 1.00 | 38.3237 | 0.995 |
2.4绘制校准曲线
以峰面积为纵坐标，以总磷浓度（mg/L）为横坐标，按照表1校准系列绘制校准曲线，得到回归方程：y=38.4957*x+0.0062，其中斜率b=38.4957，截距a=0.0062，相关系数R=0.9999，说明线性良好，校准曲线见下图1。
图1 总磷校准曲线图
2.5测定样品
对于清洁的地表水样品可以直接进行测定，对于悬浮物或颗粒物较多的样品需超声震碎混匀后经适当稀释后再取样，以免堵塞管路，如果样品测试浓度高于校准曲线的最高点，要对样品进行稀释，50倍以下的样品可在线自动稀释，否则需手工稀释。
3、结果分析与讨论
3.1空白实验
在测空白实验前，一般会测试几个载流，如果出现负峰或锯齿形峰形，可能是试剂污染，此时应停机检查，出峰正常后用适量的纯水代替样品，按照与样品分析相同步骤进行测定，记录信号值（峰面积），空白实验结果低于方法检出限方可进行样品的分析测试。
3.2方法检出限和测定下限
根据HJ168-2020中方法检出限的一般确定方法，按照样品分析的全部步骤[8]，将曲线最低浓度点0.02 mg/L（即方法标准检出限的4倍值）平行测定11次，计算11次平行测定的标准偏差，当n=11，置信水平为99%时，t=2.764，按公式（2）计算方法检出限，检出限为0.004mg/L低于0.005mg/L的方法检出限，说明用流动注射法测试低浓度总磷样品时，比较稳定，灵敏度较高，具体结果如下表2。
MDL=t（n-1,0.99）×S （2）
表2 方法检出限和测定下限试验
序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
浓度（mg/L） SD（mg/L） 检出限（mg/L） 测定下限（mg/L） | 0.018
| 0.020 | 0.018 | 0.020 | 0.021 | 0.019 0.0014 0.004 0.016 | 0.018 | 0.020 | 0.021 | 0.022 | 0.019 |
注：测定下限为4倍检出限。
3.3精密度与正确度
按照2.1的实验条件，取高低两种浓度标准样品进行精密度与正确度测试，将低浓度标样200645和高浓度标样200219在线稀释2倍后分别平行测定7次，测试值和均值均在标样保证值范围内，其中低浓度标样RSD测试值为1.55%，高浓度标样RSD测试值为0.67%，均远低于方法中当总磷浓度＞0.02mg/L时RSD≤10%的要求，说明用流动注射法测试总磷准确度较高，结果见表3。
表3 正确度和精密度试验
标样 | 测定均值（mg/L） | 相对误差（%） | 标准偏差（mg/L） | RSD（%） |
200219 200645 | 1.13 0.272 | 0.9 0.7 | 0.0076 0.0042 | 0.67 1.55 |
3.4平行双样和加标回收率
对地表水样品849进行6次平行测定，对地表水样品DB1318、DB1326、DB1322、DB1311和污水样品WS773、WS773-XP1进行了平行双样和加标回收率的测试。样品849、DB1318、DB1326、DB1311、WS773用浓度为10mg/L的总磷标准溶液分别加标0.5ml、5ml、1ml、, 0.5ml、2ml，然后定容到100ml。实际样品平行双样测试的RSD最高为7.9%，最低为0.0%，RSD均≤10%，说明样品测试平行性和重现性较好。实测加标回收率在90.5%～106%之间，说明样品测试准确度较高，测试具体结果见下表4。
表4 实际样品加标回收率试验
样品 | 测定均值（mg/L） | 加标后测定值（mg/L） | 加标回收率（%） | RSD(%) |
849 DB1318 DB1326 DB1322 DB1311 WS773 WS773-XP1 | 0.016 0.412 0.041 0.050 0.048 0.155 0.154 | 0.063 0.919 0.137 / 0.093 0.349 / | 94.2 106 96.4 / 90.5 98.6 / | 7.9 0.12 0.00 0.00 1.0 0.00 1.0 |
注：“/”表示未做加标。
3.5方法比对试验
分析总磷时实验室最常用的方法为钼酸铵分光光度法（GB/T 11893-89），所以本次选择该方法与流动注射-钼酸铵分光光度法（HJ 671-2013）作方法比对。选择以下地表水和污水实际样品进行方法比对，结果显示，RSD最小值为0.0%，最大值为8.8%，RSD值均＜10%，表明两种方法的相关性较好，结果见表5。
表5 两种方法比对试验
样品编号 | GB/T 11893-89 浓度（mg/L） | HJ 671-2013 浓度（mg/L） | RSD（%） |
DB1364 DB1364室内平行 DB1365 DB1366 DB1367 DB1368 DB1368-XP1 DB1369 WS803 WS804 WS805 WS807 WS808 | 0.060 0.049 0.034 0.037 0.060 0.107 0.107 0.081 2.58 0.286 1.50 2.60 1.72 | 0.055 0.056 0.038 0.037 0.058 0.108 0.100 0.089 3.08 0.292 1.67 2.62 1.77 | 4.3 6.7 5.6 0.0 1.7 0.5 3.4 4.7 8.8 1.0 5.4 0.4 1.4 |
4、方法差异比对分析
4.1钼酸铵分光光度法
在样品预处理阶段，钼酸铵分光光度法一般不需要对水样进行预处理，而是在样品消解后采取相应的措施[9]，直接取样品25ml加入4ml过硫酸钾溶液后放入高压灭菌器在120℃消解30min，等高压灭菌器压力降为零时取出放冷，先后分别加入1ml抗坏血酸溶液和2ml钼酸铵溶液充分混匀后显色15min，使用光程为30mm的比色皿在700nm波长处以水作参比测定吸光度[10]。该方法从室温到120℃消解完毕需要约2小时，自然降压至仪器可开盖温度约1小时，高压消解前处理耗时长，此外，样品消解后仍然有颗粒物时，样品需要抽滤（采测分离要求对所有样品消解后进行抽滤），消解液颜色较深时需要用色度浊度补偿液进行校正，这些都是导致效率不高的主要原因，在应急加密监测时，总磷数据出具时间慢的缺点尤为突出。此外，遇到加急样品急需报数时，为节约时间分析人员会在仪器消解完后手工泄压，具有一定的危险性。该方法最大的优点是测试准确度和精密度高，测试稳定性、重现性较好，缺点也显而易见，就是耗时长，取样量较大，操作比较繁琐，消解时间长，需经常使用高压灭菌器，操作安全风险较大。
4.2流动注射法
在样品预处理阶段，水样中不含悬浮物，低色度的清洁地表水可直接测定，对混浊、色度较深的水样，用0.45 um 滤膜过滤[11]。仪器完成自检、清洗后可开始检测，从进样、加试剂、消解、比色、测定、数据处理全过程自动化处理，平均不到3分钟分析一个样品，测试效率极高，且进样量小每次约4ml，还可以实现在线消解和紫外消解同步进行，消解时间短，保证同一批样品的分析测试条件基本一致，利于减少外界干扰，保证样品测试的稳定性，尤其有助于大批量样品和加急样品的分析测试。对于浊度高的样品，尤其是渗滤液等污水样品，需超声混匀后经适当稀释取样分析测定。该方法最大的优点是分析速度快，准确度、精密度高，试剂和样品消耗少，且可以自动稀释，自动计算结果，可直接报数，缺点是载流溶液被污染，容易出现负峰，泵管容易疲劳影响进样量。
5、注意事项
5.1对悬浮物较多或颗粒粒径大于250um的样品，测试前必须超声10分钟以上，然后再视情况适当稀释后测定，因为流动注射仪泵管较细容易堵塞。
5.2流动注射实验室应安装空调保证分析过程中室温波动控制士2℃以内，贮存在冰箱的试剂取出后必须放置至室温后再使用，因为试剂和环境温度都会影响分析结果。
5.3配制的试剂必须保证溶液澄清，且均需经超声脱气完全后才能进入流路，因为气泡在封闭的化学反应系统中会干扰测定。
5.4每次分析前后，必须用纯水对所有分析管路进行清洗，以免造成污染。
5.5分析完毕须排空管路中的液体后将所有泵管拔出卡槽，因为泵管疲劳导致使用寿命变短。
5.6当样品pH＜2或pH＞10时均会对测定产生干扰，为减少pH对样品测试的干扰，应在分析前将样品的pH调至中性。
5.7废液管不能过长，应保持跟仪器在同一水平面上，否则易导致堵管和漏液。
6、结论
采用流动注射法测定水质中的总磷，相关系数达到0.9999，检出限为0.004mg/L，测定下限为0.016mg/L，用实际样品测得加标回收率为96.2%~106%。对高低两个不同浓度标准样品进行7次平行测定，测得值均在保证值范围内，其相对标准偏差分别为0.67%和1.55%。以上结果表明，使用流动注射法测定地表水和污水中总磷，方法灵敏度高、检出限低、操作简便快捷、试剂用量少，分析速度快，每小时可连续分析几十个样品。经与钼酸铵分光光度法比对，其方法的线性、精密度和准确度符合分析要求，尤其在分析大批量样品时，优先推荐使用该方法测定水中总磷。
参考文献：
[1] 王丽平,赵萍,田芹等.流动注射法测定水中总磷的方法改进[J].理化检验,2011,47（10）:1137-1139
[2]郭少维,姜鑫.流动注射法测定水中总磷的研究[J].环境卫生工程,2011,19（6）:58-59
[3]林秀珍.流动注射法测定水体中总磷[J].福建分析测试,2006,15（3）:42-44
[4]王晓燕,陈家厚,赵晓婧.流动注射法测定水中的总磷[J].黑龙江环境通报,2008,32（4）:71-75
[5]水质总磷的测定 流动注射-钼酸铵分光光度法:HJ 671-2013[S]
[6]地表水和污水监测技术规范:HJ/T 91-2002[S]
[7]污水监测技术规范HJ 91.1-2019[S]
[8]环境监测分析方法标准制订技术导则:HJ 168—2020[S]
[9]姚德飞,骆煜昊,夏峥等.浊度对总磷自动监测的干扰影响及消除方法初步探讨[J].Modern Scientific Instruments,2020,12（6）:35-41
[10]水质总磷的测定钼酸铵分光光度法:GB/T 11893-89[S]
[11]罗展纲,杨敏,黄碧兰.在线紫外/过硫酸盐消解-流动注射法分析测定水中总磷[J].中国卫生检验,2013,23（8）:1888-1890
作者简介：黄亮（1991-）男，广东韶关，大学本科，生态环境监测工程师，邮箱：597201640@qq.com。
通讯作者：张奇（1982-）男，大学本科，高级工程师
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