量子化学计算研究4种甘薯黄酮清除自由基活性的构效关系
张文婷，孙健*，钮福祥，朱红，岳瑞雪，张毅，徐飞，马晨
（江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/中国农业科学院甘薯研究所，江苏 徐州 221131）
摘 要：以甘薯中含有的槲皮素、木犀草素、杨梅素和鼠李柠檬素4种黄酮类分子作为研究对象，使用密度泛函方法计算得出4种分子的结构参数、分子前线轨道分布（HOMO&LUMO）、能隙△E等理论参数，分析了四种甘薯黄酮类化合物清除自由基的活性，同时实测4种化合物对DPPH自由基的清除活性。通过数据分析初步判断出这4种黄酮类化合物抗氧化活性的大小顺序为：杨梅素＞槲皮素＞木犀草素＞鼠李柠檬素，而实际测得的抗氧化活性顺序为槲皮素>杨梅素>木犀草素>鼠李柠檬素。这是因为槲皮素分子构型为平面构型，有利于抗氧化清除自由基反应时形成稳定的自由基中间体。
关键词：量子化学计算；黄酮；自由基；密度泛函理论
中图分类号：O641
The study on the structure activity relationship of scavenging free radical activity of 4 kinds of sweet potato flavones by quantum chemistry calculation
ZHANG Wenting SUN Jian* NIU Fuxiang ZHU Hong YUE Ruixue ZHANG Yi XU Fei MA Chen
(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai District/Jiangsu Xuzhou Sweet Potato Research Center, Xuzhou, 221131, Jiangsu, China)
Abstract: Taking quercetin, luteolin, myricetin and rhamnocitrin contained in sweet potato as the research object, using the density functional theory to calculate the structural parameters of 4 kinds of molecules, molecular frontier orbital distribution (HOMO & LUMO), energy gap △E and other theoretical parameters, the free radical scavenging activities of four sweet potato flavonoids were analyzed, and the scavenging activities of four compounds on DPPH free radicals were measured. Through data analysis, it is preliminarily judged that the order of the antioxidant activity of these four flavonoids is: myricetin>quercetin>luteolin>rhamnolimonin, the actual measured antioxidant activity sequence is quercetin>myricetin>luteolin>rhamnolimonin. This is because the molecular configuration of quercetin is planar, which is conducive to the formation of stable free radical intermediates during antioxidant scavenging reaction.
Keywords: quantum chemical calculation; flavone; free radical; density functional theory
自由基是指化合物的分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。人体的新陈代谢会产生大量的自由基，这些堆积自由基可能会导致细胞功能的丧失和基因的损伤，造成诸如肿瘤、心脑血管疾病、机体衰老等其他病症[1-3]，因此寻找高效、绿色、低毒的抗氧化剂是当务之急。
甘薯叶含有丰富的天然黄酮类化合物[4-6]，具有抗癌、增强免疫机制和调节心血管疾病等多种生物活性，而清除自由基功能是其最广泛深入的研究[7-9]。目前，对甘薯黄酮类化合物抗氧化性的研究主要集中在分离和结构鉴定方面，而对于从量子化学的理论角度阐述甘薯黄酮抗氧化机理的研究还相对较少。
量子化学是以量子力学理论为基础，探究原子电荷分布、键能、焓变及分子间作用力等化学问题的一门理论学科[10]，密度泛函法(Density Functional Theory, DFT)是应用最广泛的计算方法。DFT方法的主要目标就是用电子密度取代波函数做为研究的基本量，具有计算精度高、速度快的特点[11-12]。近年来，量子化学计算法被广泛使用[13-14]，例如杨怡萌[15]等研究表明，荷叶中5种黄酮化合物自由基清除活性的排序依次为槲皮素>异鼠李素>山奈酚>金丝桃苷>紫云英苷。胡栋宝[16]等研究结果显示紫花苜蓿中黄酮类化合物的抗氧化活性的大小顺序为:槲皮素>木犀草素>染料木素>芒柄花黄素。
本课题组前期研究了甘薯材料中黄酮类化合物的提取及活性分析[17-18]，以此为基础，选取甘薯叶中4种黄酮类抗氧化物（槲皮素、木犀草素、杨梅素和鼠李柠檬素）进行量子化学计算。利用DFT算法，计算得出分子优化构型和结构参数、分子前线轨道分布情况、前线分子轨道能以及前线轨道能级差ΔE等相关量化理论参数，考察其与黄酮类抗氧化物清除自由基活性相关关系。
1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
槲皮素(98%)、木犀草素(98%)、杨梅素(98%)和鼠李柠檬素(98%)等均购买自北京世纪奥科生物技术有限公司。Tris-HCl缓冲液，硫酸亚铁，DPPH·试剂盒等试剂购买于美国Sigma公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 实验仪器
UV-2450紫外分光光度计：日本岛津公司；微量移液器：Finnpipette美国热电公司：上海精宏实验设备有限公司；YP1002N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；Gaussian 16软件：Gaussian, Inc., Wallingford CT, USA等。
1.3 实验方法
1.3.1 二苯基－三硝基苯肼（DPPH·）清除活性的测定
测定方法参照相关文献[19-20]。
1.3.2 计算模型与方法
模型构建和计算方法参照相关文献[21]。计算采用Gaussian 16程序软件完成，计算平台由西北农林科技大学提供。
2 结果与分析
2.1 甘薯黄酮分子优化构型和结构参数分析
四种黄酮分子（槲皮素、杨梅素、鼠李柠檬素和木犀草素）的优化结构如图1所示，不同酚羟基位点O-H键键长、C-O-H键角及二面角数据见表1。
槲皮素 杨梅素
鼠李柠檬素 木犀草素
图1 四种黄酮分子的几何构型优化图
黄酮分子的O-H键断裂得到半醌式自由基，其难易程度决定了黄酮自由基清除能力的强弱。O-H键越长，越容易断裂，得到半醌式自由基越容易，即自由基清除性能越强。
表1 4种甘薯叶片黄酮化合物的酚羟基O-H键长及∠C-O-H键角参数
结构参数 | 槲皮素 | 杨梅素 | 鼠李柠檬素 | 木犀草素 |
R(C1-OH)/nm | 1.362 | 1.362 |
| 1.362 |
R(C5-OH)/nm | 1.353 | 1.353 | 1.354 | 1.354 |
R(C21-OH)/nm |
|
|
|
|
R(C23-OH)/nm |
| 1.359 |
| 1.376 |
R(C25-OH)/nm | 1.361 | 1.359 |
| 1.358 |
R(C26-OH)/nm |
|
| 1.364 |
|
R(C27-OH)/nm | 1.375 |
|
| |
∠C(5)-O-H/(°) | 108.364 | 108.371 | 108.271 | 108.376 |
∠C(1)-O-H/(°) | 109.087 | 109.089 |
| 109.128 |
∠C(23)-O-H/(°) |
| 106.824 |
| 107.615 |
∠C(25)-O-H/() | 109.262 |
| 109.954 | |
∠C(26)-O-H/(°) |
|
| 109.259 |
|
∠C(27)-O-H/(°) | 109.908 | 108.582 |
|
|
二面角/(°) | 0 | 9.1 | 12.4 | 10.5 |
从表1可以发现，4种甘薯黄酮化合物中，O-H键键长分布在1.353 nm-1.401 nm之间，含有C1-OH的槲皮素、杨梅素和木犀草素均为1.362 nm。对比这三种黄酮，杨梅素的O-H数量最多，且杨梅素C27-OH键长较其他两个对应点的键长略长（1.401和1.375、1.358 nm），初步认为三者的自由基清除率活性排序为杨梅素>槲皮素>木犀草素，由于鼠李柠檬素O-H数量少，其自由基清除活性最低。因此，从O-H键长角度评价，得出4种甘薯黄酮分子自由基清除能力次序依次为杨梅素>槲皮素>木犀草素>鼠李柠檬素。
分析C-O-H键角数据，得出其键角的分布范围在107.615°-109.954°之间。在槲皮素分子中，∠C(25)-O-H（109.262°）的数值略小于∠C(27)-O-H（109.908°），这是由于C25-OH上的氢原子和C25-OH上的氧原子可以形成分子内氢键，使得氢原子更靠近于羟基方向，从而造成∠C(25)-O-H键角被压缩，数值偏小。同理，在杨梅素分子中，∠C(23)-O-H（106.824°）略小于∠C(25)-O-H（109.262°），这是因为C(23)-O-H上的氢原子和C27-OH上的氧原子形成了分子内氢键。另外，木犀草素分子中∠C(23)-O-H键角数值（107.615）也因为分子内氢键的存在而偏小[16]。
黄酮分子内存在0°～90°的二面角，分子不共面影响其发生反应时的电子转移。如图1和表1所示，杨梅素、鼠李柠檬素和木犀草素这三个分子中的三个环不在同一平面。杨梅素B环与A和C环所在平面形成9.1°的二面角，鼠李柠檬素B环与A和C环所在平面则形成12.4°的二面角，木犀草素B环与A和C环所在平面形成10.5°的二面角。而槲皮素分子中的二面角为0°，其C(2)-C(3)之间的双键的存在使整个槲皮素分子处于同一平面，C环作为连接环，扩展了其共轭体系，这种平面结构有利于自由基中间体的形成，因此槲皮素的抗氧化活性较高[22]。
2.2 前线分子轨道分布和能隙△E与抗氧化活性关系
根据分子轨道理论，E(HOMO)表征分子的给电子的能力，E(HOMO)值越大，分子的给电子的能力就越强；E(LUMO)表征分子的吸电子的能力，E(LUMO)越小，分子的吸电子能力就越强。△E（HOMO-LUMO）（能隙）是指孤电子从HOMO跃迁到LUMO所需要的能量，它和分子的稳定性呈正相关关系[23-24]。HOMO和LUMO的分布情况可以直观判断出黄酮分子清除自由活性的主要作用部位[25-26]。本文运用B3LYP/6-31G(d, p)方法对4种黄酮类化合物的前线轨道电子云分布进行了计算，结果见图2-3。同时，对轨道能隙也进行了计算，结果见表2。
表2 4个黄酮化合物的前线分子轨道（HOMO和LUMO）的轨道能和能隙（eV）
杨梅素 | 鼠李柠檬素 | 木犀草素 | ||
ELUMO/eV | -0.00270 | -0.00227 | -0.01210 | -0.00889 |
EHOMO/eV | 0.00579 | 0.00395 | 0.00747 | 0.00616 |
△E/eV | 0.00849 | 0.00622 | 0.01957 | 0.01505 |
注：EHOMO和ELUMO为前线分子轨道（HOMO和LUMO）的轨道能；△E为能隙。
根据表2可知，4种黄酮分子中，杨梅素△E最小（0.00622 eV），鼠李柠檬素△E最大（0.01957 eV）。其△E顺序为：杨梅素△E＜槲皮素△E＜木犀草素△E＜鼠李柠檬素△E；根据量子化学分子轨道理论，可推测4种黄酮分子抗氧化活性顺序为杨梅素>槲皮素>木犀草素>鼠李柠檬素。
图2 槲皮素和木犀草素前线分子轨道分布图
（HOMO&LUMO）
图3 杨梅素和鼠李柠檬素前线分子轨道分布图
（HOMO&LUMO）
由于不同取代基给电子和吸电子能力不一样，黄酮分子π电子云分布发生不均匀现象，从而相应的HOMO和LUMO轨道分布均相应发生变化。给电子能力强的基团，电子云密度将增加，如HOMO图所示；吸电子能力强的基团，电子云密度将会增加，如LUMO图所示。从HOMO和LUMO轨道图分析表明，黄酮分子发生自由基清除反应时，其B环以及C环上与B环共轭的部分集中了高反应活性的部位，这些部位是也是发生自由基清除反应能力较高的活性部位。从HOMO图也可看出，黄酮分子B环中的3′，4′位羟基更多地参与前线轨道分布。
2.3 4种黄酮化合物清除自由基能力测定
实验使用DPPH自由基清除率为指标，表征4种黄酮的抗氧化活性，由表3可知，测得的清除自由基活性顺序为：槲皮素>杨梅素>木犀草素>鼠李柠檬素。
表3 4个黄酮化合物的DPPH自由基清除率
黄酮类化合物 | DPPH自由基清除率/% |
槲皮素 | 82.24±0.053 |
杨梅素 | 50.64±0.047 |
木犀草素 | 49.20±0.054 |
鼠李柠檬素 | 23.15±0.039 |
3 讨论与结论
本研究采用密度泛函理论(DFT)的计算方法，从分子优化构型和结构参数分析、前线分子轨道分布和能隙△E与抗氧化活性关系三个方面研究了甘薯中4种黄酮化合物抗氧化活性的构效关系，得出四个黄酮化合物的抗氧化活性大小顺序为杨梅素＞槲皮素＞木犀草素＞鼠李柠檬素，而实际测得的抗氧化活性顺序为槲皮素>杨梅素>木犀草素>鼠李柠檬素。一般而言，黄酮类化合物酚羟基的个数越多，其抗氧化能力就越强，可推出杨梅素的抗氧化活性高于槲皮素，但通过实验验证，结果并非如此。因此不能以黄酮分子中羟基个数作为其抗氧化能力的判据。
研究表明，黄酮分子的抗氧化活性与共轭体系相关[22]。槲皮素分子构型为平面构型，分子内氢键的形成有利于其平面共轭体系结构，增大了电子离域程度，有利于抗氧化清除自由基反应时形成稳定的自由基中间体。因而槲皮素具有较好的抗氧化活性。该研究为进一步开发甘薯黄酮天然抗氧化剂提供理论基础。
参考文献
[1] Alkadi H. A Review On Free Radicals and Antioxidants[J]. 2018.45(3):443-451.
[2] 刘科梅, 邬子彬, 胡基志, 等. 类胡萝卜素清除自由基活性构效关系[J]. 食品工业科技, 2018, 39(16): 59-64.
[3] 刘科梅, 聂挺, 潘栋梁, 等. 4种异黄酮抗氧化活性的构效关系[J]. 食品科学, 2016, 37(23): 1-6.
[4] 赵珊, 仲伶俐, 秦琳, 等. 不同干燥方式对甘薯叶功能成分及抗氧化活性的影响[J]. 中国农业科学, 2021, 54(21): 4650-4663.
[5] 黄雨, 王璐璐, 李佳欣, 等. 10个叶菜型甘薯品种茎尖总黄酮质量分数及其稳定性的分析与评价[J]. 西南师范大学学报(自然科学版), 2021, 46(10): 51-57.
[6] 石婕, 符雪影, 吴强, 等. 甘薯叶片的抗氧化活性和相关成分比较[J/OL]. 热带生物学报, 2021, 1-9[2021-12-01]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1078.S.20210628.0915.002.html.
[7] 李宝兰, 张咏梅, 卢小康,等. 苜蓿总黄酮对小鼠脂类代谢及氧自由基的影响[J]. 江西农业学报, 2008, 20(12): 99-101.
[8] 李东, 向仲怀, 何宁佳. 桑树类黄酮化合物研究现状及进展[J]. 蚕业科学, 2021, 47(05): 482-490.
[9] 刘雪艳, 查代君. 黄酮类活性成分的代谢研究进展[J]. 福建医科大学学报, 2021, 55(04):358-366.
[10] Nandini G, Sathyanarayana D N. Ab initio studies on geometry and vibrational spectra of N-methyl formamide and N-methylacetamide[J]. Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, 2002, 579(1): 1-9.
[11] 黄张君, 张文华, 曾运航,等. 白酒贮存过程中主要成分间氢键相互作用的量子化学计算[J]. 食品科学, 2021, 42(12): 45-51.
[12] 王淳纯, 覃小丽, 阚建全, 等. 量子化学计算法比较不同脂肪酸分子的反应活性位点[J]. 食品科学, 2021, 42(08): 74-80.
[13] Braidy N, Matin A, Rossi F, et al. Neuroprotective effects of rosmarinic acid on ciguatoxin in primary human neurons[J]. Neurotoxicity Res, 2014, 25:226-234.
[14] Lee H J, Cho H S, Park E, et al. Rosmarinic acid protects human dopaminergic neuronal cells against hydrogen peroxide-induced apoptosis. Toxicology, 2008, 250:109-115.
[15] 杨怡萌, 杨广梅, 王仲明, 等. 荷叶黄酮自由基清除活性的量子化学研究[J]. 分子科学学报, 2020, 36(06): 489-496.
[16] 胡栋宝, 伍贤学, 陈文静, 等. 紫花苜蓿中4种黄酮类化合物抗氧化活性的DFT研究[J]. 天然产物研究与开发, 2017, 29:1666-1670, 1727.
[17] 孔秀林, 张文婷, 孙健, 等. 甘薯叶片中多酚类物质的提取及抗氧化活性研究[J]. 江苏师范大学学报(自然科学版), 2018, 36(02): 34-37+41.
[18] 张文婷, 王洪云, 孙健, 等. 不同品种及生长期甘薯叶片多酚和黄酮含量动态分析[J]. 江西农业学报, 2019, 31(11): 17-22+28.
[19] 唐晓姝, 胡博, 陈雪梅, 等. 6种小型浆果营养成分及DPPH自由基清除活性比较[J]. 江苏农业科学, 2021, 49(20): 182-187.
[20] 黄丽丽, 陈婵婵, 汪佳兵, 等. 查尔酮类似物清除DPPH自由基和保护H2O2诱导的PC12细胞损伤的抗氧化活性[J]. 温州医科大学学报, 2021, 51(07): 542-547+553.
[21] 胡栋宝, 赵剑雄, 等. 中药满山红中4个黄酮类化合物结构及其抗氧化活性的理论研究[J]. 中国中药杂志, 2016, 41(14): 2675-2679.
[22] 胡冬华, 高艳辉, 陈雪松. 等. 几种玉米须黄酮分子结构性质及抗氧化活性的量子化学研究[J]. 东北师大学报(自然科学版), 2009, 41(4): 108-111.
[23] 李春香, 郭宁. 分子轨道理论的应用及展望[J]. 金田, 2014.(8):32-36.
[24] 张鑫. 甘草和黄芪中的黄酮类化合物清除自由基机理的密度泛函理论研究[D]. 河南师范大学，2013.
[25] AGNIHOTRI N, MISHRA P C. Mechanism of Scavenging Action of N-acetylcysteine for the OH Radical:a Quantum Computational Study[J]. The Journal of Physical Cemistry B, 2009, 113(35): 12096-104.
[26] Zhang X, Yang YJ, Lv QZ. Den-sity functional theory calculations on antioxidation activity offour flavones from Radix Glycyrrhizae. Comp Applied Chem, 2012, 29:656-660.
订阅方式：
①在线订阅（推荐）：www.sdchem.net.cn
②邮局订阅：邮发代号24-109
投稿方式：
①在线投稿（推荐）：www.sdchem.net.cn
作者只需要简单注册获得用户名和密码后，就可随时进行投稿、查稿，全程跟踪稿件的发表过程，使您的论文发表更加方便、快捷、透明、高效。
②邮箱投稿：sdhgtg@163.com sdhg@sdchem.net
若“在线投稿”不成功，可使用邮箱投稿，投稿邮件主题：第一作者名字/稿件题目。
投稿时请注意以下事项：
①文前应有中英文“题目”、“作者姓名”、“单位”、“邮编”、“摘要”、“关键词”；
②作者简介包括：姓名、出生年、性别、民族、籍贯或出生地、工作单位、职务或职称、学位、研究方向；
③论文末应附“参考文献”，执行国标GB/T7714-2005标准，“参考文献”序号应与论文中出现的顺序相符；
④注明作者的联系方式，包括电话、E-mail、详细的通讯地址、邮编，以便联系并邮寄杂志。
欢迎投稿 答复快捷 发表迅速